12.2.1 Cromatografía en capa fina (CCF)
12.2.2 Cromatografía en columna (CC)
12.2.1 Cromatografía en capa fina (CCF)
En la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico.
La CCF es una técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una mezcla de componentes.
El proceso es similar a la cromatografía de papel con la ventaja de que se desarrolla más rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre diferentes adsorbentes. La CCF es una técnica estándar en el laboratorio de química orgánica. Debido a su simplicidad y velocidad, la CCF se utiliza a menudo para monitorizar las reacciones químicas y también para el análisis cualitativo de los productos de una reacción, puesto que permite conocer de manera rápida y sencilla cuántos componentes hay en una mezcla.
Procedimiento
Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa delgada de un sólido adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una pequeña cantidad de la muestra problema en disolución en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatográfica, de forma que sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido o eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad.
A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla problema se establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los componentes en la mezcla que son adsorbidas y las que se encuentran en disolución.
En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su adsorción, de forma que unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando el eluyente llega a la parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de la mezcla se visualizan.
Visualización de las manchas
Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es así, hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la mezcla.
- Utilizar luz ultravioleta (UV254) para observar la placa. Normalmente se adiciona un colorante fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en todas partes excepto donde haya una mancha correspondiente a un compuesto orgánico.
- Utilizar reveladores, por ejemplo, vapores de yodo que es un reactivo inespecífico.
- Emplear reactivos específicos para desarrollar coloración en las manchas. Esto se puede hacer sumergiendo la placa de CCF en una disolución que los contenga o en forma de spray.
Cálculo del factor de retención Rf
Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la placa. Cada compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente empleado y del tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente. De esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se hacen eluir en la misma placa de CCF).
12.2.2 Cromatografia en columna
Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla.
Procedimiento
La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.
La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten más eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.
En 1978 se introdujo una versión modificada denominada cromatografía en columna rápida. La diferencia con la cromatografía en columna tradicional es que en la técnica rápida el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una presión positiva. Esto hace que las separaciones mejoren en resolución y se pueda disminuir el tiempo de elución, por lo cual constituye un método de elección.
Análisis de los eluatos de la columna
Si los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados, el progreso de la separación se puede monitorizar visualmente. No obstante, a menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones de eluatos en tubos rotulados y la composición de cada fracción se analiza por cromatografía en capa fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se reúnen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los componentes por métodos espectroscópicos.