12.7.1 Cromatografía en papel

En la cromatografía sobre papel, las interacciones del soluto con el papel hacen que los compuestos se desplacen a velocidades diferentes.

Una pequeña mancha de disolución que contiene la muestra se aplica sobre una tira de papel cromatográfico a una distancia aproximada de un centímetro de la base. La muestra es adsorbida en el papel. Esto significa que la muestra entra en contacto con el papel y puede establecer interacciones. El papel es sumergido en un disolvente adecuado (etanol o agua) e introducido en un contenedor cerrado. A medida que el disolvente asciende por el papel, encuentra la muestra que empieza a viajar por el papel con el disolvente. Los diferentes compuestos de la muestra recorren distancias diferentes dependiendo de la fuerza de sus interacciones químicas con el papel. La cromatografía en papel requiere algún tiempo, habitualmente se necesitan varias horas para completarse.

El cromatograma final puede ser comparado con otros de mezclas conocidas a fin de identificar los componentes de la muestra. La cromatografía en papel de dos dimensiones consiste en desarrollar el cromatograma en un disolvente, girar el papel 90º y desarrollar el cromatograma en un disolvente diferente. Es útil para separar mezclas complejas de compuestos similares.

Actualmente, la cromatografía en papel se utiliza poco y ha sido ampliamente reemplazada por la cromatografía en capa fina. No obstante, todavía se utiliza como una poderosa herramienta pedagógica.

 

12.7.2 Cromatografía de intercambio iónico

Se trata de una cromatografía en columna que utiliza una fase estacionaria con sustancias con componentes con carga eléctrica. Se utiliza para separar compuestos cargados, incluyendo aminoácidos, péptidos y proteínas. La fase estacionaria es normalmente una resina de intercambio iónico que contiene grupos funcionales cargados que interaccionan con grupos cargados de signo opuesto del compuesto que se quiere retener. Puede ser:

1. Intercambiador de iones cargado positivamente (intercambiador de aniones), que interacciona con aniones
2. Intercambiador  de iones cargado negativamente (intercambiador  de cationes), que interacciona con cationes

Los compuestos retenidos se pueden eluir de la columna por gradiente de elución o por elución isocrática con un cambio de la concentración salina o del pH. La cromatografía de intercambio iónico es muy utilizada para purificar proteínas.

 

12.7.3 Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

Se suele denominar HPLC, y es una forma de cromatografía en columna que se utiliza a menudo en bioquímica y química analítica. La muestra problema es forzada a pasar a través de una columna (fase estacionaria) por un líquido (fase móvil) a elevada presión, lo que disminuye el tiempo que los componentes separados permanecen en la fase estacionaria, y por lo tanto, el tiempo de difusión dentro la columna. En la salida de la comuna existe un detector que indica la cantidad de soluto que está saliendo. Este proceso de difusión dentro la columna comporta la aparición de picos anchos y pérdida de resolución. El hecho de estar menos tiempo en la columna se traduce en picos más estrechos en el cromatograma resultante así como una mayor resolución y sensibilidad.

Otra manera de disminuir el tiempo que la muestra está dentro de la columna es utilizar un gradiente de disolventes, que consiste en cambiar la composición de la fase móvil a fin de acelerar la salida de la muestra del interior de la columna. Se pueden considerar dos tipos:

 

Fase normal

Se utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se usa principalmente cuando la muestra a analizar es de naturaleza apolar. Fue el primer tipo de HPLC, pero hoy en día ha sido muy desplazado por la fase reversa.

Fase reversa

Se desarrolló debido al elevado número de biomoléculas polares. La fase estacionaria es apolar y la fase móvil polar. Una de las fases estacionarias más empleadas es sílice tratada con RMe2SiCl, donde R es una cadena alquílica como CnH2n+1 . En este caso, para una determinada sustancia, el tiempo de retención aumenta con la polaridad de la fase móvil.

 

12.7.4 Cromatografía de permeación en gel (GPC)

La cromatografía de permeación en gel se conoce también como cromatografía de exclusión por tamaño, porque separa las moléculas según su dimensión. Las moléculas pequeñas entran en un medio poroso y por tanto les cuesta más salir de la columna, dejando las partículas más grandes eluir primero. La GPC es una técnica muy empleada para determinar la distribución del peso molecular en polímeros, aunque suele proporcionar baja resolución.

 

12.7.5 Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en interacciones no covalentes selectivas entre la muestra y moléculas específicas. Es muy específica, pero no muy consistente. Se utiliza mucho en bioquímica para la purificación de proteínas.

 

12.7.6 Cromatografía gas-líquido

La cromatografía gas-líquido se fundamenta en el reparto del equilibrio de la muestra a analizar entre una fase estacionaria líquida y una fase móvil gaseosa. Es una técnica útil para una gran variedad de mezclas no polares, pero es poco eficiente para moléculas termolábiles.